產品內容：

產品簡介：
“雙報告基因”檢測系統通常被用來提高實驗精確度，即在一個系統中同時表達和測量兩個獨立的報告基因。一般來說，實驗組報告基因與具體實驗條件的影響是相關的，而共同轉染的內對照組報告基因則是用來充當校正參數，作為內參提供反應基線。將實驗組的結果與內對照組的結果進行約化處理，可降低由細胞存活率或轉染效率的差異而導致的結果波動，同時還可消除儀器測定引起的實驗誤差。因此，雙報告基因檢測可以通過減少外部影響來獲得更可靠的實驗數據。

美侖NANO&FIREFLYGLO雙螢光素酶報告基因檢測系統是一種輝光型定量檢測試劑盒，具有高靈敏度和發光信號穩定的特點，符合高通量檢測的需求。該檢測試劑盒在同一個樣品中先以一種新型螢光素為底物來檢測螢火蟲螢光素酶（Firefly luciferase），后以新型底物來檢測NANOLIGHT螢光素酶，同時淬滅Firefly luciferase的螢光信號，實現雙螢光素酶報告基因檢測。
相比于美侖輝光型FIREFLY&RENILLALIGHT雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒（MA0520），本品NANO&FIREFLYGLO Luciferase Reporter Assay Kit（MA0522）具有以下優點：采用了全新的螢光素酶檢測新型底物和NANOLIGHT螢光素酶，具有更高的發光強度，該輝光型試劑盒近乎達到了閃光型雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒（MA0518）的靈敏度；具有更好的發光信號的穩定性，近乎2小時的信號半衰期為實驗設計提供了更大的靈活性；高通量檢測無需依賴自動進樣器，并且無需棄培養液、離心等步驟，簡化了實驗流程；本試劑盒組分做了大量優化，與傳統閃光型產品相比，無明顯刺激性氣味。NANO&FIREFLYGLO雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒可用于多種常用細胞培養液：RPMI 1640、DMEM 、MEM-α、F12、DMEM/F12等，其半衰期均為2小時左右（22℃），滿足絕大多數高通量實驗需求。
反應原理如下：

 

1.自備材料
PBS；多道排槍；白色不透光細胞培養板；化學發光儀或酶標儀。

2.檢測前準備
1）首次使用時將Dual-FIREFLYGLO EX Luciferase Reaction Buffer一次性全部倒入Dual-FIREFLYGLO EX Luciferase Substrate瓶中，充分混勻直至所有底物溶解。按使用需求進行分裝，建議-70℃長期保存或者短期存放于 -20℃不超過一個月，并盡快使用。
2）Stop & NANOLIGHT Substrate (100x)，每次開蓋前需進行短暫低速離心。
3）根據實際使用量，以100:1的比例將適量的Stop & NANOLIGHT Reaction Buffer與Stop & NANOLIGHT Substrate (100x)混勻，室溫避光備用。例如：如果需要100ml反應液，則需要加入1ml的檢測底物。
注：建議現配現用，剩余的含有底物的反應液在當次實驗結束后，直接舍棄，不要留存。

3.操作方法

1）從細胞培養箱中取出細胞培養板，放置5-15min，恢復至室溫。
注：使用白色不透光的細胞培養板，減少孔間的信號干擾。

2）Firefly Luciferase反應檢測
a．使用多道排槍向每個細胞孔中加入平衡至室溫的含有底物的Dual-FIREFLYGLO EX Luciferase Reaction Buffer，加樣體積與細胞培養液體積相同并混勻。由于需要分別加入兩種檢測溶液，為防止孔板液體溢出，96孔板建議加入80ul培養液，相應加入80ul檢測溶液。
b．室溫下孵育5-10min。為了使細胞裂解充分，也可將細胞培養板放在振蕩混勻儀或附帶振板功能的儀器上，室溫條件下，采用中高速振板5-10min。
注：孵育時間，可根據細胞量進行適當調整，確保細胞充分裂解，得到穩定的發光檢測結果。
c．孵育后于化學發光儀或酶標儀中檢測Firefly Luciferase報告基因活性。
注：發光信號會逐漸衰減，為得到最佳檢測結果，請在加入檢測試劑后2小時內完成檢測。

3）NANOLIGHT Luciferase反應檢測
a．使用多道排槍向每個細胞孔中加入平衡至室溫的含有底物的Stop & NANOLIGHT Reaction Buffer，加樣體積與初始細胞培養液體積相同并充分混勻。例如，96孔板建議加入80ul培養液，相應加入80ul檢測溶液。
b．將細胞培養板放在振蕩混勻儀或附帶振板功能的儀器上，室溫條件下，采用中高速振板至少3min。使溶液充分混勻，得到最佳淬滅效果。
c．孵育至少10min后（包括前面振板3min）于化學發光儀或酶標儀中檢測NANOLIGHT Luciferase報告基因活性。
注：發光信號會逐漸衰減，為得到最佳檢測結果，請在加入檢測試劑后2小時內完成檢測。

注意事項：

1．檢測儀器選擇：能夠檢測化學發光的儀器都適用本試劑盒的檢測，但是針對相同的樣品，不同檢測器本底信號值和測量值均可能不同；且對于同一樣本檢測，不同儀器的數值不可橫向比較。為防止孔間干擾，推薦使用不透明白色細胞培養板。
2．由于發光信號會受到檢測環境如培養基組分、溫度等影響，所以應確保同組內不同樣本檢測條件一致。
3．酶促反應對溫度較為敏感，加樣檢測前務必將檢測試劑以及細胞培養板平衡至室溫。
4．NANOLIGHT螢光素酶具有超強信號穩定性，半衰期可達2小時。但是當酶表達量過高時，信號半衰期會縮短，建議優化實驗設計方案（如減少質粒轉染量），避免螢光素酶表達量過高。
5．為取得最佳檢測結果，加入Stop & NANOLIGHT Reaction Buffer后，需要孵育至少10min才可以檢測NANOLIGHT Luciferase報告基因活性，其中包括振動混勻至少3min。

保存條件：

全新試劑盒-20℃保存，一年有效。
溶解分裝后的Dual-FIREFLYGLO EX Luciferase Substrate于-70℃避光保存一年，或-20℃短期保存不超過一個月。
短期運輸條件：

避光冷藏。

數據展示

 
圖1. NANO&FIREFLYGLO發光淬滅效果對比P進口品牌。相同濃度的NANOLIGHT、Firefly螢光素酶的體系中，依次加入FIREFLYGLO和Stop&NANOLIGHT反應液，分別記錄兩者螢光素酶的發光強度以及淬滅情況。由圖可知，美侖組的雙酶發光強度與P進口品牌基本無差別，并且淬滅效率要高于P進口品牌。

 
圖2. NANOLIGHT/FIREFLYGLO發光穩定性對比P進口品牌。螢光素酶在一定濃度范圍內，Meilunbio的NANOLIGHT/FIREFLYGLO的絕對光強與P進口公司非常接近；而且Meilunbio的NANOLIGHT發光穩定性在體外NANOLIGHT酶檢測中要好于P進口品牌。
 
圖3. NANOLIGHT/FIREFLYGLO線性范圍驗證。單一時刻下，美侖NANOLIGHT、FIREFLYGLO螢光素酶濃度-光強標曲線性良好（R2(NANOLIGHT)=0.999；R2(Firefly)=0.999）

 
圖4. NANOLIGHT/FIREFLYGLO在不同培養基發光檢測。圖中數據分別以各自的RPMI-1640組做歸一處理，美侖NANOLIGHT/FIREFLYGLO發光體系在常用培養基：MEMα、F12、DMEM/F12、DMEM、RPMI-1640中都可以正常發光。
 
圖5. NANOLIGHT/FIREFLYGLO酚紅耐受能力檢測。配制含有酚紅濃度梯度的PBS溶液0-20mg/L，每組分別加入等量的NANOLIGHT螢光素酶或螢火蟲螢光素酶，再檢測NANOLIGHT、FIREFLYGLO 的發光效果。由圖可知，Meilunbio? NANOLIGHT/FIREFLYGLO對比P進口公司具有更強的酚紅耐受能力。

 
圖6. 細胞培養體系中NANOLIGHT /FIREFLYGLO光強穩定性(A)和細胞密度-光強標曲(B)示例。在細胞培養基環境中，原位追蹤檢測NANOLIGHT和FIREFLYGLO發光。由圖可知，NANOLIGHT和FIREFLYGLO螢光穩定性和絕對光強與P進口品牌基本一致；而且，美侖組單一時刻條件下的細胞密度-光強標曲線性良好（R2=0.999（NANOLIGHT）；R2=0.996（Firefly））。

 
圖7. TNFα 梯度誘導NF-κB信號通路檢測效果對比P進口品牌。HEK-293T細胞共轉染了NANOLIGHT_PEST螢光素酶NF-κB response reporter 和Firefly螢光素酶內參質粒。轉染后12h，進行TNFα濃度梯度（0-20ng/ml）誘導5h后，在細胞培養體系內，按照說明書步驟依次孵育并使用酶標儀分別檢測雙酶的信號讀值，并對NANOLIGHT和FIREFLYGLO光強進行約化處理（NANOLIGHT/Firefly）。由圖可以明顯看出NANOLIGHT /Firefly比值與給藥濃度呈正相關，并且美侖組的檢測效果與P進口品牌無明顯差異。（儀器：BioTek HTX）

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